師兄師兄,反轉(zhuǎn)錄完成了,終于到最后一步——熒光定量PCR!欸,師兄,話說熒光定量PCR是什么?。?/span>
PCR你總知道吧?
知道啊,PCR就是聚合酶鏈式反應(yīng),是把DNA變多的技術(shù)!
差不多吧……是通過特定引物,將目的序列擴增到百萬倍以上的技術(shù)方法,但這只是表明目的序列的有無,并不能確定初始模板量的多少。
熒光定量PCR就是為了解決這個問題而研究出的技術(shù)方法,real time PCR、quantity PCR(qPCR)一般都是指的它。
那與普通PCR的區(qū)別就在于熒光定量了么?
對,就是在每一次PCR循環(huán)的延伸階段,檢測熒光信號強度,根據(jù)信號強度變化就可以推算出初始模板量了。
感覺好復雜!這些都要我自己計算么?
這個要你慢慢學習,最好是能夠明白其中原理?,F(xiàn)在可以先關(guān)注CT值,這個是比較直觀的實驗數(shù)據(jù),它的大小對應(yīng)初始模板量的大小。
還有就是擴增曲線、熔解曲線等圖表,你的實驗是否成功它們說了算。
哦,好的師兄。那我去做qPCR實驗了!
等等!要記得加樣順序:按除模板外體系中各組分體積占比從大到小的順序添加,最后添加模板!這樣可以最大程度避免加樣誤差以及
實驗過程中可能的交叉污染。
特別注意不要在試劑區(qū)加模板,不然你未使用的mix非常容易被污染!
知道啦,師兄!