師兄師兄，反轉(zhuǎn)錄完成了，終于到最后一步——熒光定量PCR！欸，師兄，話說熒光定量PCR是什么??？

PCR你總知道吧？

  知道啊，PCR就是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是把DNA變多的技術(shù)！

差不多吧……是通過特定引物，將目的序列擴(kuò)增到百萬(wàn)倍以上的技術(shù)方法，但這只是表明目的序列的有無(wú)，并不能確定初始模板量的多少。

熒光定量PCR就是為了解決這個(gè)問題而研究出的技術(shù)方法，real time PCR、quantity PCR（qPCR）一般都是指的它。

  那與普通PCR的區(qū)別就在于熒光定量了么？

對(duì)，就是在每一次PCR循環(huán)的延伸階段，檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度變化就可以推算出初始模板量了。

  感覺好復(fù)雜！這些都要我自己計(jì)算么？

這個(gè)要你慢慢學(xué)習(xí)，最好是能夠明白其中原理?，F(xiàn)在可以先關(guān)注CT值，這個(gè)是比較直觀的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，它的大小對(duì)應(yīng)初始模板量的大小。

還有就是擴(kuò)增曲線、熔解曲線等圖表，你的實(shí)驗(yàn)是否成功它們說了算。

  哦，好的師兄。那我去做qPCR實(shí)驗(yàn)了！

等等！要記得加樣順序：按除模板外體系中各組分體積占比從大到小的順序添加，最后添加模板！這樣可以最大程度避免加樣誤差以及

實(shí)驗(yàn)過程中可能的交叉污染。

特別注意不要在試劑區(qū)加模板，不然你未使用的mix非常容易被污染！

  知道啦，師兄！