產(chǎn)品介紹

試劑盒提供的2× Blue Real PCR Easy? Mix-SYBR是一種使用SYBR Green I進(jìn)行Real Time PCR擴(kuò)增反應(yīng)的全新預(yù)混系統(tǒng)，能大幅度提高產(chǎn)物特異性和反應(yīng)靈敏度。同時(shí)，提供ROX作為內(nèi)參染料。該試劑盒的熒光強(qiáng)度為同類產(chǎn)品的3-5倍，能更靈敏的、更直觀的反應(yīng)目的模板DNA的濃度。

2× Blue Real PCR Easy? Mix-SYBR包含抗體法修飾的熱啟動(dòng)酶Foreasy HS Taq DNA Polymerase，該酶相對(duì)于普通Taq酶具有擴(kuò)增效率高、特異性擴(kuò)增能力強(qiáng)、錯(cuò)配率低等優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)還包含藍(lán)色指示劑，便于移液示蹤，有效減少移液錯(cuò)誤。

運(yùn)輸及儲(chǔ)存條件

1.     運(yùn)輸條件：全程低溫冰盒運(yùn)輸。

2.     保存條件：避光保存于-20℃；若頻繁使用，也可置于4℃短期保存(限10天內(nèi)用完)。

試劑盒內(nèi)容

2× Blue Real PCR Easy? Mix-SYBR：包含抗體修飾的熱啟動(dòng)酶Foreasy HS Taq DNA Polymerase、MgCl2、優(yōu)化配比的dNTPs和SYBR Green I、反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑、優(yōu)化劑、穩(wěn)定劑以及指示劑等。PCR反應(yīng)時(shí)，只需將適當(dāng)?shù)哪０?、引物、DNase-ddH2O添加到2× Blue Real PCR Easy? Mix-SYBR中即可用于PCR反應(yīng)。

ROX Reference Dye：一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR擴(kuò)增儀上，用于調(diào)整PCR加樣誤差所引起的 PCR管與管之間的差異。不同儀器所需ROX Reference Dye濃度不同，用戶可以根據(jù)儀器的推薦濃度添加。

DNase-Free ddH2O：超純水，用于補(bǔ)齊擴(kuò)增體系剩余體積。

試劑盒原理

試劑盒使用了熱啟動(dòng)Foregene Taq DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過檢測(cè)反應(yīng)液中SYBRGreen I的熒光強(qiáng)度，達(dá)到監(jiān)控PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBRGreen I熒光染料，SYBR Green I熒光染料特異性地?fù)饺?/span>DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBRGreen I染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBRGreen I與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出熒光，可以通過檢測(cè)反應(yīng)體系中的SYBRGreen I熒光強(qiáng)度，達(dá)到檢測(cè)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。

Real Time PCR引物設(shè)計(jì)原則

Forward Primer和Reverse Primer

進(jìn)行Real TimePCR，引物設(shè)計(jì)非常重要。引物關(guān)系到PCR擴(kuò)增的特異性、高效性等，可以參照以下原則進(jìn)行引物設(shè)計(jì)：

u  引物長度：18-30bp。

u  GC含量：40-60%。

u  Tm值：引物設(shè)計(jì)軟件，如Primer 5，可以給出引物的Tm值。上下游引物的Tm值應(yīng)    盡量接近。也可以使用Tm計(jì)算公式：Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)。進(jìn)行PCR時(shí)，一般選擇低于引物Tm值5℃的溫度作為退火溫度（相應(yīng)的提高退火溫度可以增加PCR反應(yīng)的特異性）。

u  引物及PCR產(chǎn)物：

v  設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度最好在100-150bp。

v  應(yīng)盡量避開在模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域設(shè)計(jì)引物。

v  避免上下游引物3’端之間形成2個(gè)或2個(gè)以上的互補(bǔ)堿基。

v  引物3’端堿基不能存在多余3個(gè)連續(xù)的G或C。

v  引物自身不能存在互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，否則會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，影響PCR擴(kuò)增。

v  引物序列中ATCG應(yīng)盡量分布均勻，3’端堿基避免為T。