獨(dú)特的PCR優(yōu)化體系，使2× Real PCR EasyTM Mix-Taqman具有更強(qiáng)的兼容性。
熱啟動(dòng)Foregene Taq Polymerase，具有更高的擴(kuò)增效率、更高的擴(kuò)增靈敏度、更高的擴(kuò)增特異性。
2× Real PCR EasyTM Mix-Taqman使用Foregene優(yōu)化的獨(dú)特體系，提高sequence-specific probe檢測(cè)的靈敏度和特異性。
本產(chǎn)品附帶有ROX內(nèi)參染料，可用于消除信號(hào)本底及孔間信號(hào)誤差，方便客戶用于不同型號(hào)定量PCR儀使用。
產(chǎn) 品 名 稱 | 熒光定量PCR試劑盒-Taqman探針?lè)?/span> Real Time PCR EasyTM-Taqman | ||
貨 號(hào) | QP-01022 | QP-01024 | |
規(guī) 格 | 500 × 20 μL rxns | 2000 × 20 μL rxns | |
價(jià) 格 | ￥1,213.00 | ￥4,138.00 | |
| 描 述 | 使用特異熒光探針進(jìn)行Real Time PCR擴(kuò)增反應(yīng)，能大幅度提高產(chǎn)物特異性和反應(yīng)靈敏度。 | ||
產(chǎn)品介紹
Real Time PCR EasyTM-Taqman試劑盒提供的2× Real PCR EasyTM Mix-Taqman是一種使用特異熒光探針進(jìn)行Real Time PCR擴(kuò)增反應(yīng)的全新預(yù)混系統(tǒng)，能大幅度提高產(chǎn)物特異性和反應(yīng)靈敏度。同時(shí)，提供ROX作為內(nèi)參染料。該Real Time PCR Mix擴(kuò)增效率高，能更靈敏的、更直觀的反應(yīng)目的模板DNA的濃度。
2× Real PCR EasyTM Mix-Taqman包含本公司特有的熱啟動(dòng)ForegeneTaq DNA Polymerase，該酶相對(duì)于普通Taq酶具有擴(kuò)增效率高、特異性擴(kuò)增能力強(qiáng)、錯(cuò)配率低等優(yōu)點(diǎn)。用于熒光定量PCR反應(yīng)可減少非特異性擴(kuò)增，提高PCR的準(zhǔn)確性。
試劑盒應(yīng)用
熒光定量PCR進(jìn)行模板定量分析/常規(guī)PCR擴(kuò)增/可用于等位基因的檢測(cè)。
儲(chǔ)存條件
本試劑盒避光保存于-20°C；若頻繁使用，也可置于4°C短期保存(限10天內(nèi)用完)。
試劑盒內(nèi)容
2× Real PCR EasyTM Mix-Taqman：包含福際生物特別改造的熱啟動(dòng)Taq DNA Polymerase、MgCl2、優(yōu)化配比的dNTPs、反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑、優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑等。PCR反應(yīng)時(shí)，只需將適當(dāng)?shù)牧呀饣旌弦?、引物?/span>DNase-ddH2O添加到2× Real PCR EasyTM Mix-Taqman中即可用于PCR反應(yīng)。
ROX Reference Dye：一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR擴(kuò)增儀上，用于調(diào)整PCR加樣誤差所引起的 PCR管與管之間的差異。不同儀器所需ROX Reference Dye濃度不同，用戶可以根據(jù)儀器的推薦濃度添加。
DNase-Free ddH2O：超純水，用于PCR反應(yīng)。
試劑盒原理
PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。再通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程熒光信號(hào)的積累，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比進(jìn)行定量分析。
Real Time PCR引物設(shè)計(jì)原則
Forward Primer和Reverse Primer
進(jìn)行Real TimePCR，引物設(shè)計(jì)非常重要。引物關(guān)系到PCR擴(kuò)增的特異性、高效性等，可以參照以下原則進(jìn)行引物設(shè)計(jì)：
u 引物長(zhǎng)度：18-30bp。
u GC含量：40-60%。
u Tm值：引物設(shè)計(jì)軟件，如Primer 5，可以給出引物的Tm值。上下游引物的Tm值應(yīng) 盡量接近。也可以使用Tm計(jì)算公式：Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)。進(jìn)行PCR時(shí)，一般選擇低于引物Tm值5℃的溫度作為退火溫度（相應(yīng)的提高退火溫度可以增加PCR反應(yīng)的特異性）。
u 引物及PCR產(chǎn)物：
v 設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度最好在100-150bp。
v 應(yīng)盡量避開在模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域設(shè)計(jì)引物。
v 避免上下游引物3’端之間形成2個(gè)或2個(gè)以上的互補(bǔ)堿基。
v 引物3’端堿基不能存在多余3個(gè)連續(xù)的G或C。
v 引物自身不能存在互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，否則會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，影響PCR擴(kuò)增。
v 引物序列中ATCG應(yīng)盡量分布均勻，3’端堿基避免為T。
Probe
探針選擇要保守，引物選擇要保守，因此必須找一段100-200bp相對(duì)要保守的片段來(lái)設(shè)計(jì)引物與探針。即real-time PCR的擴(kuò)增片段是50bp-150bp。當(dāng)找不到150bp的保守片段時(shí)，必須確保探針的片段是保守的。一般按照以下原則進(jìn)行Probe的設(shè)計(jì)：
u 探針位置盡可能地靠近上游引物。
u 探針長(zhǎng)度應(yīng)在15-45bp(最好是20-30bp)，以保證結(jié)合特異性。
u 檢測(cè)探針的DNA折疊和二級(jí)結(jié)構(gòu)。
u Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃(至少要5℃)，GC含量在40%-70%。
u 探針的5’端應(yīng)避免使用G鳥嘌呤——因?yàn)?/span>5’G會(huì)有淬滅作用，而且即使是被切割下來(lái)還會(huì)存在淬滅作用。
u 整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量——G含量高會(huì)降低反應(yīng)效率，這時(shí)就應(yīng)選擇配對(duì)的另一條鏈作為探針。
u 為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計(jì)好的序列在blast中核實(shí)一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計(jì)引物探針。
說(shuō)明書
產(chǎn)品文獻(xiàn)
MSDS
COA
無(wú)擴(kuò)增信號(hào)
Answer
1. 試劑盒中的TaqDNA Polymerase因試劑盒保存不當(dāng)或過(guò)期而失去活性。
建議：確認(rèn)試劑盒的保存條件；重新在PCR體系中添加適量Taq DNA Polymerase或者購(gòu)買新的Real Time PCR Kit試劑盒進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
2. DNA模板中存在大量的Taq DNA Polymerase的抑制因子。
建議：重新純化模板或降低模板的使用量。
3. Mg2+濃度不適合。
建議：我們提供的2× Real PCR Mix的Mg2+濃度為3.5 mM。但針對(duì)有些特殊的引物和模板可能需要的Mg2+濃度較高，因此可直接添加MgCl2進(jìn)行Mg2+濃度的優(yōu)化，建議每次增加0.5mM的Mg2+進(jìn)行優(yōu)化。
4. PCR擴(kuò)增條件不適合、引物序列或者濃度不當(dāng)。
建議：確認(rèn)引物序列的正確性以及引物沒(méi)有降解；擴(kuò)增信號(hào)不好時(shí)，可嘗試降低退火溫度，適當(dāng)調(diào)整引物濃度等。
5. 模板用量問(wèn)題，太少或過(guò)多。
建議：可進(jìn)行模板線性化梯度稀釋，選擇PCR效果最好的模板濃度進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)。
NTC出現(xiàn)過(guò)高的熒光值
Answer
1. 在操作過(guò)程中導(dǎo)致的試劑污染。
建議：更換新的試劑進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)。
2. PCR反應(yīng)體系配制時(shí)發(fā)生污染。
建議：操作時(shí)進(jìn)行必要的防護(hù)措施，比如：戴乳膠手套，使用帶濾芯的槍頭等。
3. 引物出現(xiàn)降解，引物降解會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)。
建議：可使用SDS-PAGE電泳檢測(cè)引物是否降解，更換新的引物進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)。
出現(xiàn)引物二聚體或非特異性擴(kuò)增
Answer
1. Mg2+濃度不適合。
建議：我們提供的2× Real PCR EasyTM Mix的Mg2+濃度為3.5 mM。但針對(duì)有些特殊的引物和模板可能需要的Mg2+濃度較高，因此可直接添加MgCl2進(jìn)行Mg2+濃度的優(yōu)化，建議每次增加0.5mM的Mg2+進(jìn)行優(yōu)化。
2. PCR退火溫度過(guò)低。
建議：每次增加1℃或者2℃進(jìn)行PCR退火溫度的優(yōu)化。
3. PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)。
建議：Real Time PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度最好在100-150bp之間，不要超過(guò)500bp。
4. 引物出現(xiàn)降解，引物降解會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)。
建議：可使用SDS-PAGE電泳檢測(cè)引物是否降解，更換新的引物進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)。
5. PCR體系不當(dāng)，或體系太小。
建議：PCR反應(yīng)體系太小會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)精度降低。最好使用定量PCR儀推薦的反應(yīng)體系重新進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)。
定量值重復(fù)性差
Answer
1. 儀器故障。
建議：儀器的每一個(gè)PCR孔之間可能存在誤差，在溫度管理或檢測(cè)時(shí)產(chǎn)生重現(xiàn)性較差現(xiàn)象。請(qǐng)根據(jù)相應(yīng)儀器的說(shuō)明書進(jìn)行點(diǎn)檢。
2. 樣品純度不好。
建議：樣品不純會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較差，這包括模板、引物的純度。最好進(jìn)行模板的再純化，引物最好使用SDS-PAGE純化。
3. PCR體系配制放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
建議：Real Time PCR體系配制好后立即用于PCR實(shí)驗(yàn)，不要擱置太長(zhǎng)時(shí)間。
4. PCR擴(kuò)增條件不適合、引物序列或者濃度不當(dāng)。
建議：確認(rèn)引物序列的正確性以及引物沒(méi)有降解；擴(kuò)增信號(hào)不好時(shí)，可嘗試降低退火溫度，適當(dāng)調(diào)整引物濃度等。
5. PCR體系不當(dāng)，或體系太小。
建議：PCR反應(yīng)體系太小會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)精度降低。最好使用定量PCR儀推薦的反應(yīng)體系重新進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)。
本產(chǎn)品是專門為Real Time PCR研制的快速去除基因組DNA污染的逆轉(zhuǎn)錄體系。5× gDNase Mix能在42°C，2min快速去除RNA中殘留的基因組，有效的避免了基因組對(duì)qPCR結(jié)果的干擾。
本產(chǎn)品是專門為Real Time PCR研制的逆轉(zhuǎn)錄體系，預(yù)混優(yōu)化配比的反轉(zhuǎn)錄引物（Oligo(dT)引物和隨機(jī)引物），無(wú)需單獨(dú)添加。
便捷的逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混體系Master Premix，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物適用于克隆全長(zhǎng)cDNA，qPCR等。
